问答题简述蛋白质免疫印迹法的基本原理和主要操作步骤。

第1题：

第2题：

简述免疫印迹法的原理。

正确答案: 免疫印迹法亦称为Westemblot，由SDS-PAGE、蛋白质转印和酶免疫测定三项技术结合而成。抗原等蛋白样品经SDS处理后带负电荷，SDS-PAGE时从阴极向阳极泳动，分子量小者，泳动速度快；然后将凝胶中已经分离的蛋白质条带在电场作用下转移至硝酸纤维素膜上；最后将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用，加λ能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色；根据电泳时加λ的分子量标准，可确定各组分的分子量。

第3题：

简述薄层色谱法的主要操作步骤是什么？

正确答案: （1）薄层板的制备
（2）点样
（3）展开
（4）显色与检视
（5）记录

第4题：

用来鉴定蛋白质的技术是（）

• A、亲和层析
• B、离子交换层析
• C、Northern印迹法
• D、Southern印迹法
• E、Western印迹法

正确答案:E

第5题：

简述DNA-蛋白质亲和层析法的基本原理。

正确答案:该法的基本原理是根据序列特异性DNA结合蛋白与其特异的DNA结合序列的可逆性结合作用，以特异DNA序列作为配体，用层析方法将蛋白质分离纯化。

第6题：

简述间接免疫荧光法（IFA）检测人血清出血热IgG抗体的具体操作步骤。

正确答案: 1）用pH7.4，0.02mol/LPBS稀释待检血清，从1：20开始做2倍或4倍连续稀释至需要的稀释度；
2）取出抗原片，用蒸馏水漂洗后，冷风吹干；
3）用加样器依次从高稀释度到低稀释度逐个加入已稀释的待检血清，加入量以覆盖细胞抗原面为准（若为双份血清，最好上排为急性期血清，下排为恢复期血清），在37℃水浴箱湿盒孵育30～40分钟（每次试验同时设阳、阴性对照）；
4）用PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，再用蒸馏水洗涤1次脱盐，冷风吹干；
5）用含1：3万的伊文思兰PBS按工作浓度稀释荧光结合物，滴加各孔（以覆盖细胞抗原面为准），在37℃水浴箱湿盒孵育30分钟；
6）同4）洗涤、漂洗、吹干；
7）荧光显微镜观察结果。

第7题：

简述蛋白质免疫印迹法的基本原理和主要操作步骤。

正确答案: 蛋白质印迹法又称蛋白质免疫印迹法，是20世纪70年代末80年代初在蛋白质凝胶电泳和固相免疫测定的基础上发展起来的蛋白质检测技术，为检测样品中是否存在蛋白质抗原提供了一种可靠的方法。该法鉴定蛋白质的原理是根据被测蛋白能与特定抗体的结合特性和该蛋白的相对分子质量。
免疫印迹法程序可分为5个步骤：
（1）蛋白样品的制备；
（2）经过SDS-PAGE分离样品；
（3）分离的蛋白转移到膜载体上，转移后首先将膜上未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性吸附；
（4）用固定在膜上的蛋白质作为抗原，与对应的非标记抗体（一抗）结合；
（5）洗去未结合的一抗，加入酶耦联或放射性同位素标记的二抗，通过显色或放射性自显影法检测凝胶中的蛋白成分。

第8题：

简述氨基酸自动分析仪测定食品中的游离氨基酸基本原理及操作步骤。

正确答案:食品中的蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，在通过分光光度计比色测定氨基酸含量。主要仪器：氨基酸自动分析仪、真空泵、恒温干燥箱、真空干燥箱。
操作步骤：1、水解：将称号的样品放于水解管中，在水解管内加盐酸，加入心蒸馏的苯酚3-4滴，接到真空泵的抽气管上，抽真空，待压力接近0Pa时，充入高纯氮气，再抽真空充氮气，重复三次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖，将已封口的水解管放在110的恒温干燥箱，水解22小时后，取出冷却。打开水解管，过滤水解液后，转移定溶。吸取滤液与容量瓶内，真空干燥器40—50℃干燥，残留物用少许水溶解，在干燥，反复两次，用pH2.2的缓冲液溶解。
2、测定：准确吸取一定量混合氨基酸标准，用pH2.2的缓冲液稀释，作为上机测定的氨基酸标准，用氨基酸自动分析仪以外标法测定样品测定液的氨基酸含量。

第9题：

第10题：

第11题：

第12题：

第13题：

第14题：

简述断法的操作要领和步骤。

正确答案: 1、断法的操作要领，关键在于运刀的“翻”“转”。
2、所谓“翻”，就是正腕入刀，使左刀尖平着插入趾甲左下角，然后翻转刀刃，使刀尖将甲角挑起，开始入刀。
3、所谓“转”，就是在走刀过程中，用拇指和食指的推力，从右向左，转着进刀，一直到左端切断为止，在转着进刀时，不能偏离“青线”，同时，左手持脚拇指要配合动作，随刀转走。

第15题：

酶联免疫吸附实验常用的方法有（）。

• A、直接法、间接法、夹心法、竞争抑制法
• B、直接法、沉淀法、印迹法、竞争抑制法
• C、直接法、间接法、夹心法、免疫扩散法
• D、直接法、间接法、印迹法、免疫扩散法
• E、直接法、沉淀法、印迹法、免疫抑制法

正确答案:A

第16题：

免疫印迹程序有哪五个步骤？

正确答案: 1.蛋白质的制备；
2.SDS-PAGE电泳分离样品；
3.将已经分离的蛋白转移到尼龙或其他膜上，转移后首先将膜上未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性吸附；
4.用固定在膜上的蛋白质作为抗原，与对应的非标记抗体（一抗）结合；
5.洗去未结合的一抗，加入酶偶联或放射性同位素标记的二抗，通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白成分。

第17题：

简述镜面法的操作步骤。

正确答案: 目的：使被检查者能看近用区视物
A.将标记号的眼镜给顾客戴上
B.验光师与戴镜者隔着一张小桌子对面坐下
C.将一画面有注视目标的小镜子放在两人中间
D.轻戴镜者看着镜面上的注视目标并且验光师的鼻子与戴镜者的鼻子处于同一平面内
E.验光师的右眼往下看着镜子里戴镜者的右眼（与戴镜者的视线在同一平面内）
F.将笔试灯靠近验光师的右眼病照射在镜面上
G.观察戴镜者在镜面上的右眼反光点，这点应位于镜片上标记的近用参考圈内
H.重复以上步骤观察

第18题：

简述单向压缩分层总和法计算地基沉降的基本原理和计算步骤。

正确答案: 单向压缩分层总和法计算地基沉降的基本原理：采用分层总和法计算地基沉降时，将地基沉降计算深度范围内的土体划分为若干分层，假定每一分层土体只发生竖向压缩变形，没有侧向变形，并将地基看作均质地基计算出每一分层土的平均附加应力，则采用压缩性指标即可计算出每一层土的压缩量，然后将各分层土的压缩量相加，得到总的压缩变形量即为地基沉降量。
计算步骤：地基的分层；计算各分层土的平均自重应力和平均附加压力；确定地基沉降计算深度；确定计算深度范围内各分层土的压缩指标；确定计算深度范围内各分层土的压缩量；对计算深度范围内各分层压缩量求和，得到地基沉降量。

第19题：

免疫印迹法原理和需注意问题。

正确答案:免疫印迹法是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术，它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合，其操作可分成三个阶段：
第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PACE）；第二阶段为电转移；第三阶段为酶免疫定位。
需注意问题：
①许多单克隆抗体不能与变性抗原反应，因此免疫印迹实验中常选用多克隆抗体。
②在电泳之前应用免疫沉淀法将抗原进行纯化和浓缩可提高免疫印迹的灵敏度。
③IBT法在临床应用中存在一定的局限性：不同分子量的蛋白质出现电泳距离一致的条带；IBT法一般不能检出针对构象依赖表位的抗体，造成某些抗体漏检。

第20题：

第21题：

第22题：

第23题：